Optimisation de l'analyse à haut débit des cannabinoïdes dans diverses matrices sur une colonne ;C18 Ascentis® Express
Seamus Riordan-Short, Senior Chemist1, Yevgen Kovalenko, Technician1, Matthew Noestheden, Director of Operations1, Jennifer King, Program Marketing Manager2, Katherine K. Stenerson, Analytical Sciences Liaison2
1Supra Research and Development, 2Merck
Le renforcement de la législation autour du cannabis et du chanvre a accru la demande de développement et de validation de méthodes d'analyse exactes et précises pour quantifier la puissance de ce type de produits. L'analyse des cannabinoïdes présente un certain nombre de défis, et la diversité des matrices rencontrées ne fait qu'ajouter aux difficultés. La technique la plus répandue est l'HPLC/UV ; les paramètres HPLC doivent être optimisés pour maintenir une bonne séparation et une rétention stable après de nombreuses injections et avec les divers types d'échantillons analysés.
Les scientifiques de Supra Research and Development ("SupraRnD") basés à Kelowna, en Colombie-Britannique au Canada (www.suprarnd.ca), ont développé une méthode d'analyse des cannabinoïdes fiable et à haut débit, applicable à un large éventail de matrices. La société SupraRnD s'est penchée sur l'analyse du cannabis en 2015 lorsqu'elle a obtenu une licence de Santé Canada pour tester les produits à base de cannabis. En 2018, SupraRnD a été l'un des premiers laboratoires canadiens à obtenir une accréditation ISO 17025 pour l'analyse du cannabis. Sa méthode de quantification de la puissance a évolué avec le temps pour répondre aux besoins changeants de ses clients et est désormais validée pour plusieurs matrices différentes.
Conditions expérimentales
Des échantillons de fleur entière ont été congelés dans des sachets hermétiquement clos à -80 °C pendant au moins 30 minutes puis homogénéisés immédiatement.* Il est crucial d'homogénéiser un échantillon représentatif et de le fractionner lors de l'analyse de fleurs de cannabis, car la concentration en phytocannabinoïdes peut varier considérablement d'une plante à l'autre et au sein d'une même plante. Cette préparation a été suivie d'une extraction simple de 0,2 g d'échantillon au méthanol, puis d'une sonication et d'une stabilisation de l'extrait à -20 °C pendant 1 heure. L'échantillon a ensuite été centrifugé, et le surnageant dilué au 100e en vue d'une analyse HPLC. La petite taille de l'échantillon combinée à la dilution pré-analyse permet de réduire au minimum le risque de complications liées à la matrice (interférences, longévité de la colonne, etc.). Le cycle d'analyse HPLC seul, d'une injection à la suivante, dure 8 minutes. Il est donc possible de réaliser 60 injections en 8 heures, ce qui permet d'analyser davantage d'échantillons au cours d'une période de travail. Les cannabinoïdes analysés à l'aide de cette méthode sont répertoriés dans le Tableau 1.
Analyse par HPLC des cannabinoïdes
Les paramètres HPLC optimisés utilisés au final sont récapitulés dans le Tableau 2.
Les besoins suivants ont été pris en compte lors du développement de cette méthode :
- Séparation chromatographique de la totalité des 17 composés.
- Durée du cycle totale (c'est-à-dire stabilisation plus temps d'analyse) inférieure à 10 minutes.
- Méthode robuste aux performances constantes sur
- > 1000 injections avec des temps de rétention stables, tout en maintenant une bonne forme de pics et une bonne réponse.
- Convenant à différentes matrices, notamment fleur, chocolat, pommade, huile, concentré, etc.
Étalonnage de la méthode
La méthode a été étalonnée de 0,01 µg/ml à 40 µg/ml. Une dilution importante de certains échantillons a été nécessaire pour les amener dans la plage d'analyse. L'étalonnage et le dopage ont été réalisés à l'aide de matériaux de référence certifiés (MRC) Cerilliant®. Des MRC de cannabinoïdes individuels ont été dilués à 1 mg/ml (hormis pour le CBLA, dilué à 0,5 mg/ml), de même que la solution d'étalon interne, directement dans la solution A de la phase mobile, pour préparer une solution mère de 17 composés à 40 µg/ml. Pour les solutions d'étalonnage aux faibles concentrations, cette solution mère a ensuite été diluée dans un mélange 30:70 des phases mobiles HPLC A et B respectivement.
Colonnes HPLC : Ascentis® Express C18
L'analyse a été réalisée sur une colonne C18 Ascentis® Express, de 15 cm × 2,1 mm de D.I. et 2 µm. Les colonnes Ascentis® Express contiennent des particules Fused-Core® superficiellement poreuses, c'est-à-dire avec un cœur solide et une enveloppe poreuse. Cette structure de particule assure une séparation plus efficace que les particules totalement poreuses de même taille, et permet de réduire les temps d'analyse et d'abaisser la contrepression par rapport aux approches basées sur des particules plus petites (< 2 µm) totalement poreuses. L'architecture des particules des colonnes Ascentis® Express permet d'utiliser de plus grosses particules, ce qui les rend compatibles à la fois avec les systèmes conventionnels et les systèmes UHPLC. Pour cette méthode, SupraRnD a utilisé un système UHPLC même si, avec une optimisation instrumentale adaptée, il est possible d'obtenir une bonne séparation sur les systèmes conventionnels. Plus précisément, cette optimisation implique de réduire au minimum la dispersion du système. Pour ce faire, il faut réduire la longueur de tube ainsi que le diamètre interne de l'entrée et de la sortie de la colonne, et utiliser une cellule de distribution de volume < 5 µl pour les détecteurs UV.
Validation et performances de la méthode
Avant d'opter pour une colonne C18 Ascentis® Express pour valider la méthode, SupraRnD a testé six autres colonnes de chimie similaire de divers fabricants. L'équipe est parvenue a atteindre une résolution chromatographique en un court temps d'analyse avec plusieurs colonnes, mais a trouvé que la colonne C18 Ascentis® Express était la seule à donner des temps de rétention stables, en particulier pour les cannabinoïdes acides. Cela est illustré à la Figure 1, qui montre les chromatogrammes d'un étalon de contrôle obtenus pour l'injection nº 1 et l'injection nº 1140, séparées par un grand nombre d'analyses d'extraits d'échantillons.
Figure 1.Étalon de cannabinoïdes analysé sur une colonne C18 Ascentis® Express ; comparaison de l'injection nº 1 et de l'injection nº 1140.
La méthode utilisant la colonne C18 Ascentis® Express a été validée dans plusieurs matrices différentes, notamment des fleurs de houblon (servant de matrice de substitution au cannabis), de l'huile de graines de chanvre, un concentré de CBD et des pommades topiques. Les recouvrements avec le houblon étaient de 85-115 % sur une plage de dopage de 0,05 à 20 % en poids. Un récapitulatif de cette validation, ainsi que des autres matrices, est présenté dans le Tableau 3. Les limites de notification de la méthode (MRL, pour "method reporting limit") obtenues pour les cannabinoïdes (hormis le CBDV, le CBG, le CBD et le CBC dans le concentré) étaient toutes de 0,05 % en poids. La répétabilité, sous forme de % RSD, était < 4 % pour toutes les matrices. Une évaluation complémentaire a été effectuée à l'aide d'essais d'aptitude : la méthode a passé les tests avec succès pour les échantillons de fleur de cannabis et d'huile de chanvre.
* Recouvrement du CBD non quantifié en raison des forts taux rencontrés
** Recouvrement du Δ9-THC non quantifié en raison des forts taux rencontrés
Ŧ La présence de CBDV, CBG, CBD et CBC dans la matrice a causé des problèmes, empêchant le calcul de la MRL pour ces composés
La Figure 2 donne des exemples de chromatogramme de fleurs de houblon dopées à 1 % p/p et à la concentration MRL de 0,05 % p/p. Au taux de dopage bien plus bas, où l'interférence de la matrice était plus évidente, la totalité des 17 cannabinoïdes ont pu être distingués des pics de bruit de fond et analysés. Les interférences éluant spécifiquement à côté des THCV et CBL étaient probablement dues à des terpènes particuliers présents dans l'échantillon de houblon. Ces pics n'ont pas été observés dans la fleur de cannabis. Dans un échantillon de pommade dopé (Figure 3), tous les cannabinoïdes ont clairement été détectés à la MRL.
Figure 2 .Fleurs de houblon, dopées à 1 % de cannabinoïdes.
Fleurs de houblon, dopées à 0,05% de cannabinoïdes.
Figure 3.Pommade contenant un extrait de cannabis, dopée à 0,05 % en poids.
À ce jour, > 1 550 injections ont été réalisées sur une même colonne C18 Ascentis® Express. SupraRnD n'a remarqué jusqu'ici aucune augmentation significative de la contrepression de la colonne ni aucune dégradation significative de ses performances. Les données de contrepression recueillies au cours de l'utilisation de la colonne montrent une hausse nette de 2 %. Ils ont aussi noté que les temps de rétention étaient stables, ce qui leur a permis de gagner en confiance dans l'identification des pics de cannabinoïdes dans les échantillons. Un exemple est illustré à la Figure 4, qui compare deux matrices différentes, du chocolat noir et une fleur de cannabis. Les deux échantillons contenaient des quantités mesurables de Δ9-THC, et la différence de temps de rétention entre les deux matrices s'est avérée minime.
Figure 4.Comparaison du profil d'élution d'un échantillon de chocolat noir et d'un échantillon de fleur de cannabis (non dopés).
Conclusion
Après avoir évalué plusieurs colonnes de HPLC, SupraRnD a réussi à développer une méthode robuste utilisant une colonne C18 Ascentis® Express pour l'analyse de 17 cannabinoïdes dans diverses matrices. Jusqu'à présent, la méthode a été appliquée avec succès à cinq types d'échantillon différents : fleur, pommades, chocolat, concentrés et bonbons gélifiés. La colonne C18 Ascentis® Express a été choisie pour la méthode finale du fait de la stabilité de ses temps de rétention, analyse après analyse, et de sa capacité à conserver ses performances chromatographiques pour les cannabinoïdes. En outre, la colonne actuellement utilisée n'a montré qu'une faible hausse de la contrepression après plus de 1500 injections.
* Après publication de ces données, SupraRnD a ultérieurement supprimé l'étape de congélation et homogénéisé les fleurs entières à température ambiante. Cela a été fait pour réduire la possibilité d'une augmentation de la teneur en humidité par la condensation de l'eau atmosphérique sur les échantillons froids.
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