Guide de sélection des réactifs de couplage peptidique

La marque Novabiochem^® propose l'une des gammes les plus complètes du marché en matière de réactifs de couplage de grande qualité pour l'activation in situ. Toutefois, avec une telle pléthore de réactifs, choisir le réactif de couplage optimal pour une application donnée n'est pas toujours chose aisée. L'efficacité de couplage, la stabilité, la solubilité et la réactivité des espèces actives varient d'un réactif de condensation à l'autre.

Réactifs d'activation in situ

Les réactifs d'activation in situ ont été largement adoptés, car ils sont faciles à utiliser, permettent d'obtenir des réactions rapides, même entre acides aminés encombrés stériquement, et leur utilisation n'entraîne généralement pas de réactions secondaires. La plupart sont basés sur des sels de phosphonium ou d'aminium (auparavant connu sous le nom d'uronium) qui, en présence d'une base tertiaire, peuvent convertir sans problème des acides aminés protégés en toutes sortes d'espèces activées (Figure 1). Les propriétés des réactifs de couplage Novabiochem sont résumées dans le Tableau 1.

Figure 1. Esters actifs générés avec les réactifs de couplage les plus couramment utilisés.

Les réactifs les plus couramment utilisés, à savoir le BOP, le PyBOP et le HBTU, créent des esters du type OBt qui sont largement employés pour les couplages difficiles en SPPS (synthèse peptidique en phase solide) de routine et dans la synthèse en solution. Il existe d'autres réactifs de couplage qui génèrent des esters qui sont plus réactifs que l'OBt. Les plus importants sont le HATU², le PyAOP^1,3, le HCTU⁴ et le PyClocK, qui, en présence d'une base, convertissent respectivement les acides carboxyliques en esters à base d'OAt et d'O-6-ClBt correspondants. Ces esters sont plus réactifs que leurs homologues du type OBt en raison du pKa plus faible du HOAt et du HO-6-ClBt par rapport à celui du HOBt. En outre, le HOAt présente l'avantage supplémentaire de posséder un azote pyridinique qui apporte une assistance anchimère à la réaction de couplage, ce qui fait du HATU et du PyAOP les réactifs de couplage les plus efficaces de la gamme des OBt.

Des réactifs de couplage basés sur le groupe partant Oxyma Pure sont récemment arrivés sur le marché, les plus utiles d'entre eux étant le COMU^5,6 et le PyOxim⁷. La preuve de la réactivité relative des esters du type Oxyma générés par ces réactifs est équivoque. Les premiers retours sur ces réactifs basés sur l'Oxyma suggèrent qu'ils sont plus efficaces que ceux basés sur le HOAt, alors que nos tests réalisés en interne⁸ indiquent que les réactifs du type HOAt sont plus performants. Toutefois, les réactifs basés sur l'Oxyma fonctionnent toujours mieux que ceux qui sont basés sur le HOBt (PyBOP, HBTU) et l'O-6-ClBt (PyClocK et HCTU). L'un des avantages notables des réactifs de couplage basés sur l'Oxyma réside dans le fait qu'ils ne sont pas apparentés à des réactifs potentiellement explosifs contenant du triazole.

Dans le cadre de nos expériences, l'efficacité d'un réactif de couplage semble reposer entièrement sur la nature de l'ester actif qu'il génère, selon l'ordre de réactivité suivant : OAt > Oxyma Pure > 2-ClOBt > OBt.  La structure de la partie uronium ou phosphonium semble avoir peu d'influence.

Réactifs à base de phosphonium versus réactifs à base d'uronium

À l'exception du COMU, les solutions de réactifs à base d'uronium dans du DMF sont exceptionnellement stables, ce qui les rend idéales pour les synthétiseurs utilisant des solutions de réactifs de couplage préalablement préparées. En revanche, les solutions de réactifs à base de phosphonium dans du DMF affichent une stabilité modérée : elles doivent être conservées dans des flacons bouchés et utilisées sous 2 jours maximum. Toutefois, les réactifs du type phosphonium sont significativement plus solubles dans le DMF que ceux du type uronium. Ce phénomène a des implications pratiques importantes, car il permet de réaliser des réactions à des concentrations plus élevées en améliorant dans le même temps le rendement.

Les réactifs de couplage à base de phosphonium donnent généralement lieu à des réactions plus propres que les réactifs à base d'uronium. Ces derniers peuvent occasionner une terminaison de la chaîne par guanidinylation du groupe aminé N-terminal⁹. Cette réaction secondaire pose problème lorsque l'activation du groupe carboxyle est lente, par exemple dans le cas des réactions de cyclisation ou du type "fragment reaction", ou si on utilise le réactif à base d'uronium en excès. La formation de ces sous-produits occasionne également des difficultés dans l'assemblage des peptides longs, car ces peptides courts chargés positivement peuvent masquer la présence de l'ion cible dans le spectre de masse ESI.  Contrairement aux réactifs du type uronium, on peut utiliser les réactifs du type phosphonium en excès, et on peut même les utiliser pour entretenir une réaction de couplage de fragments ou une réaction de cyclisation lente, afin de l'aider à atteindre un rendement de 100 %.

Figure 2. Guanidinylation occasionnée par des réactifs de couplage du type uronium.

Tableau 1. Résumé des propriétés des réactifs de couplage Novabiochem.

Réactif de couplage	Réf.	Structure	Solubilité (M)	Stabilité dans le DMF dans un flacon bouché	Réactivité des espèces actives	Commentaires
BOP	851004		> 1,5	–	4	Les sous-produits sont hydrosolubles, ce qui rend le BOP intéressant pour la synthèse en solution
COMU	851085		1,5	Faible	1/2	Réactivité élevée, potentiellement supérieure à celle du HATU pour les couplages en présence d'encombrement stérique. Non explosif. Stabilité en solution limitée. Entraîne une guanidylation.
HATU	851013		0,45	Excellente	1	Le nec plus ultra pour les couplages en présence d'encombrement stérique, mais cher par rapport à d'autres réactifs
HBTU	851006		0,5	Excellente	4	Excellent réactif pour la synthèse de routine. Peut provoquer une guanidinylation.
HCTU	851012		0,75	Excellente	3	Davantage réactif et plus cher que le HBTU. Peut provoquer une guanidinylation.
PyBOP	851009		> 1,5	Modérée. Les solutions doivent être renouvelées chaque jour.	4	Excellent réactif pour la synthèse de routine. Parfait pour l'activation in situ, car n'occasionne par de guanidinylation. Propre.
PyAOP	851221		> 1,5	Faible à modérée. Les solutions doivent être renouvelées chaque jour. Mieux vaut les conserver sous N2.	1	Excellent réactif pour les couplages en présence d'encombrement stérique, la condensation de fragments et la cyclisation de peptides. Parfait pour l'activation in situ, car n'occasionne par de guanidinylation. Propre
PyOxim	851095		> 1,5	Modérée. Les solutions doivent être renouvelées chaque jour.	1/2	Mêmes avantages que le PyBOP, mais génère une espèce active plus réactive. Propre.
TSTU	851206		–	Excellente	4	Utile pour la conversion des colorants/réactifs PEGylés en esters du type OSu compatibles avec l'eau.

Résumé des réactifs de couplage à base d'uronium et de phosphonium

Uronium	Phosphonium
Synthétiseurs utilisant des solutions mères, notamment si les solutions sont exposées à l'atmosphère	Synthétiseurs dans lesquels les solutions sont maintenues dans des récipients clos et les réactifs utilisés rapidement
Transposition à l'échelle supérieure, si le coût des réactifs constitue un point d'attention	Transposition à l'échelle supérieure, si la concentration des réactifs constitue un point d'attention
Ne peut être utilisé en excès pendant les condensations de fragments et les cyclisations	Peut être utilisé en excès pendant les condensations de fragments et les cyclisations

Références bibliographiques

1. Albericio F, Cases M, Alsina J, Triolo SA, Carpino LA, Kates SA. 1997. On the use of PyAOP, a phosphonium salt derived from HOAt, in solid-phase peptide synthesis. Tetrahedron Letters. 38(27):4853-4856. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(97)01011-3

2. Carpino LA. 1993. 1-Hydroxy-7-azabenzotriazole. An efficient peptide coupling additive. J. Am. Chem. Soc.. 115(10):4397-4398. https://doi.org/10.1021/ja00063a082

3. Albericio F, Bofill JM, El-Faham A, Kates SA. 1998. Use of Onium Salt-Based Coupling Reagents in Peptide Synthesis1. J. Org. Chem.. 63(26):9678-9683. https://doi.org/10.1021/jo980807y

4. Marder O, Shvo Y, Albericio F. 2003. HCTU and TCTU: New Coupling Reagents ? Development and Industrial Aspects. ChemInform. 34(32): https://doi.org/10.1002/chin.200332258

5. El-Faham A, Funosas RS, Prohens R, Albericio F. 2009. COMU: A Safer and More Effective Replacement for Benzotriazole-Based Uronium Coupling Reagents. Chem. Eur. J.. 15(37):9404-9416. https://doi.org/10.1002/chem.200900615

6. Subirós-Funosas R, Nieto-Rodriguez L, Jensen KJ, Albericio F. 2013. COMU: scope and limitations of the latest innovation in peptide acyl transfer reagents. J. Pept. Sci.. 19(7):408-414. https://doi.org/10.1002/psc.2517

7. Subirós-Funosas R, El-Faham A, Albericio F. 2010. PyOxP and PyOxB: the Oxyma-based novel family of phosphonium salts. Org. Biomol. Chem.. 8(16):3665. https://doi.org/10.1039/c003719b

8. Novabiochem Innovations 03/10.. [Internet]. Available from: https://www.merckmillipore.com/IN/en/reagents-chemicals-and-labware/novabiochem-learning-center/novabiochem-publications/novabiochem-innovations/J2ib.qB.rDYAAAFLHaQp.xHd,nav?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F&bd=1

9. Gausepohl H, Pieles U, Frank R. 1992. Peptides: chemistry and biology. ESCOM. Leiden.523.