Stratégie simple d'enrichissement des protéines par ultrafiltration

Le protéome plasmatique humain constitue une vaste ressource pour découvrir de nouveaux biomarqueurs et les étudier. La chromatographie par filtration sur gel est la méthode traditionnellement utilisée pour fractionner les solutions de protéines en fonction de leurs tailles^1,2. La filtration sur gel est toutefois laborieuse, limitée par le volume des échantillons et chronophage. Elle dilue également beaucoup l'échantillon. Ces limitations peuvent être surmontées par l'ultrafiltration, qui a été appliquée dans la littérature^3–5 comme méthode de préparation d'échantillons pour obtenir des fractions de faible poids moléculaire (< 10 kDa) en vue de l'analyse de biomarqueurs. Ici, des dispositifs Amicon^® Ultra ont servi à purifier du cytochrome c à partir d'un mélange contenant 10 % de sérum de veau fœtal.

Méthode

Dans cette expérience, des dispositifs d'ultrafiltration ont été employés pour enrichir des fractions de faible poids moléculaire (LMW) et de poids moléculaire élevé (HMW) issues de sérum. En adoptant une approche par filtration en série (Figure 1), les protéines ont été fractionnées en diminuant progressivement le seuil de coupure (MWCO) de dispositifs Amicon^® Ultra de 4 ml avec un MWCO allant de 100 kDa à 10 kDa.

Résultats

Cette stratégie d'enrichissement en série a permis de compartimenter les protéines et d'améliorer le débit par rapport à la filtration directe avec un dispositif de faible MWCO (Figure 2 ci-dessus). La pureté des échantillons préparés en suivant la stratégie d'enrichissement était aussi plus élevée qu'avec la filtration directe classique (Figure 3 ci-dessus). Les données montrent que l'ultrafiltration en série est une approche viable pour l'enrichissement des protéines en fonction de leur taille.

Références bibliographiques

1. Werner M. 1966. Fractionation of lipoproteins from blood by gel filtration. Journal of Chromatography A. 2563-70. https://doi.org/10.1016/s0021-9673(01)98217-2

2. Kent U. 1999. Purification of Antibodies Using Ammonium Sulfate Fractionation or Gel Filtration. Javois L.C. Immunocytochemical Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. 115(1):11-18.

3. Schulz-Knappe P, Schrader M, Ständker L, Richter R, Hess R, Jürgens M, Forssmann W. 1997. Peptide bank generated by large-scale preparation of circulating human peptides. Journal of Chromatography A. 776(1):125-132. https://doi.org/10.1016/s0021-9673(97)00152-0

4. Basso D, Valerio A, Seraglia R, Mazza S, Piva MG, Greco E, Fogar P, Gallo N, Pedrazzoli S, Tiengo A, et al. 2002. Putative Pancreatic Cancer-Associated Diabetogenic Factor: 2030 MW Peptide. Pancreas. 24(1):8-14. https://doi.org/10.1097/00006676-200201000-00002

5. Prazeres S, Santos MA, Ferreira HG, Sobrinho LG. 2003. A practical method for the detection of macroprolactinaemia using ultrafiltration. 58(6):686-690. https://doi.org/10.1046/j.1365-2265.2003.01721.x