CT01-5

MTT-Reagenz A

Useful in the study of cell & mitochondrial health, MTT is a pale yellow substrate that is cleaved by living cells to yield a dark blue formazan product.

• Synonym(e): MTT Formazan Assay
• UNSPSC Code: 12352207
• NACRES: NA.32
• eCl@ss: 32161000

Eigenschaften

• form: solid
• manufacturer/tradename: Chemicon^®
• technique(s): activity assay: suitable, cell based assay: suitable
• shipped in: wet ice
• Quality Level: 100

Beschreibung

General description

Reagenz A: MTT, (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromid), 50 mg/Fläschchen.

MTT ist ein blassgelbes Substrat, das von lebenden Zellen gespalten wird, um ein dunkelblaues Formazan-Produkt zu erhalten. Für diesen Prozess werden aktive Mitochondrien benötigt und selbst gerade abgestorbene Zellen spalten keine signifikanten Mengen an MTT. Reagenz A ist ein Bestandteil des Chemicon MTT-Assay-Kits, Artikelnummer CT01/CT02.

Application

Verfahren:
1. Mittels Standardmethoden einen Lymphokin-, Mitogen- oder Komplement-vermittelten Zytotoxizitätsassay in 96-Well-Gewebekulturplatten mit flachem Boden von hoher optischer Qualität (z. B. Falcon) durchführen. Das Endvolumen des Gewebekulturmediums in jedem Well sollte 0,1 ml betragen und das Medium (z. B. RPMI oder DMEM) kann bis zu 10 % fetales Rinderserum enthalten.

2. Am Ende des Tests 0,01 ml AB-Lösung (MTT) in jeden Well geben. Zum Mischen vorsichtig an die Seite der Schale tippen.

3. Für die MTT-Spaltung bei 37 °C inkubieren. Die optimale Zeit kann je nach Assay variieren, vier Stunden sind jedoch für die meisten Zwecke geeignet. Nach Ablauf dieser Zeit liegt das in Wells mit lebenden Zellen entstandene MTT-Formazan in Form von schwarzen, fasrigen Kristallen am Boden der Wells vor.

4. 0,1 ml Lösung C in jeden Well geben. Durch wiederholtes Pipettieren mit einer Mehrkanalpipette gründlich mischen. Das HCl wandelt das Phenolrot im Gewebekulturmedium in eine gelbe Färbung um, die die MTT-Formazan-Messung nicht beeinträchtigt. Das Isopropanol löst das Formazan auf, wodurch eine homogene blaue Lösung entsteht, die für die Extinktionsmessung geeignet ist.

5. Die Extinktion innerhalb von einer Stunde mit einem ELISA-Plattenleser mit einer Testwellenlänge von 570 nm und einer Referenz-Wellenlänge von 630 nm messen. Nach mehreren Stunden bei Raumtemperatur können die Serumproteine aufgrund der/des Säure/Alkohols allmählich ausgefällt werden. Durch Kühlen der Platten wird die Ausfällung beschleunigt. Wenn die Platten vor der Messung gelagert werden müssen, vor der Zugabe der/des Säure/Alkohols bei 4 °C aufbewahren, dann auf Raumtemperatur erwärmen und die/den Säure/Alkohol erst kurz vor dem Ablesen hinzufügen.

Ergebnisse:
Der MTT-Assay detektiert in der Regel 200 bis 50.000 Zellen einer typischen Zelllinie, wobei der effektive Bereich zwischen 1.000 und 50.000 Zellen liegt. Diese Zahlen können bei anderen Zelltypen variieren. Zytotoxizitätsassays sollten so eingerichtet werden, dass die unlysierten Kontrollzellen ein Signal von 0,2 bis 0,4 abgeben und Proliferationsassays sollten einen ähnlichen Wert bei Plateaukonzentrationen erzielen. Dies entspricht etwa 20–50.000 Zellen pro Well bei einer typischen Zelllinie.

Die Extinktion ist direkt proportional zur Anzahl der Zellen. Selbst bei Konzentrationen von 1 x 10⁶ Zellen/ml entsteht keine signifikante Extinktion durch die tatsächlichen Zellen.

Legal Information

CHEMICON is a registered trademark of Merck KGaA, Darmstadt, Germany

Sicherheitshinweise

• pictograms: GHS08,GHS07
• signalword: Warning
• hcodes: H315,H319,H335,H341
• pcodes: P201 - P202 - P261 - P302 + P352 - P305 + P351 + P338 - P308 + P313
• Hazard Classifications: Eye Irrit. 2 - Muta. 2 - Skin Irrit. 2 - STOT SE 3
• target_organs: Respiratory system
• Lagerklasse: 11 - Combustible Solids
• wgk: WGK 3
• flash_point_f: Not applicable
• flash_point_c: Not applicable