Kits de purificación de ADN y ARN GenElute™E mediante una sola centrifugación Preguntas frecuentes

La siguiente es una lista de preguntas frecuentes relacionadas con los kits de purificación de ADN y ARN mediante una sola centrifugación GenElute™-E.

Preguntas frecuentes sobre la tecnología

Preguntas frecuentes sobre la aplicación

Preguntas frecuentes sobre protocolos

En los kits de purificación de ADN y ARN con centrifugado único GenElute-E se utiliza cromatografía negativa para aislar los ácidos nucleicos. ¿Puede explicar cómo este enfoque simplifica el procedimiento de trabajo?

En lugar de optimizar los pasos de unión, lavado y liberación en las preparaciones convencionales para purificación mediante centrifugado con membranas de sílice, la tecnología se centra en la separación realizada mediante fraccionamiento de un solo paso basado en el tamaño de las biomoléculas, lo que tiene como consecuencia la eliminación de las impurezas.

¿Qué tienen de especial las enzimas SmartLyse?

Las enzimas SmartLyse™ dirigidas reducen el tiempo de lisis y permiten un procedimiento de trabajo más eficiente, liberando al científico de la tediosa manipulación de tubos al eliminar los pasos de adsorción y lavado.

Cuando se utilizan las columnas de sílice para la purificación, un científico puede eluir un volumen menor para tener una muestra más concentrada o eluir dos veces para un mayor rendimiento. ¿En qué se diferencia esta tecnología?

Cuando se eluye un volumen más pequeño utilizando sílice, se puede lograr una mayor concentración. Sin embargo, las sales residuales y el etanol necesarios para la adsorción y el lavado de la muestra también estarán presentes a una mayor concentración. Con la cromatografía negativa, el volumen que se carga es esencialmente el volumen que se recupera (normalmente ~80-100 µl), que suele estar más concentrado que las muestras de ácido nucleico aisladas con sílice. Con la sílice, durante la segunda elución se suelen liberar más contaminantes del proceso y ácidos nucleicos fragmentado más pequeños, lo que puede provocar una cuantificación imprecisa y dar lugar a una sobrevaloración del rendimiento.

¿Cómo mejora la tecnología GenElute-E la precisión de la cuantificación de ácidos nucleicos?

Cuando se utiliza cromatografía negativa para la purificación no se introducen contaminantes del proceso y se recuperan más ácidos nucleicos de longitud completa al reducir las etapas de centrifugación. Esto mejora la precisión de la cuantificación en las aplicaciones siguientes y elimina los contaminantes que pueden interferir en la propia aplicación posterior, lo que permite realizar experimentos más consistentes.

¿Qué otras ventajas ofrece GenElute-E a los investigadores?

La eliminación de los pasos de adsorción y lavado constituye un enfoque más sostenible para aislar los ácidos nucleicos, reduciendo la cantidad de tubos de plástico y el flujo de residuos químicos. Esto hace de GenElute™-E una opción de química sostenible y ecológica que es más beneficiosa para todos.

Estoy utilizando una enzima de amplificación delicada (polimerasa). ¿Elimina esta tecnología los iones Mg+2 de mis preparaciones?

¡Claro! La tecnología de purificación con centrifugado único GenElute™-E elimina los iones, lo que permite reacciones enzimáticas posteriores más robustas al garantizar que la concentración de los componentes de la disolución tampón enzimática esté mejor optimizada sin inhibidores “sorpresa”.

¿Cuál es la composición del tampón de lisis y el tampón de limpieza después de atravesar la resina?

La presencia de EDTA, SDS o exceso de sal puede afectar a mi reacción de PCR/secuenciación...

La información del tampón de lisis está patentada, pero podemos decir que carece de sales caotrópicas. Las resinas son resinas desaladoras por lo que el EDTA, la SDS y las sales se agotan. ¡Esta es la belleza de la tecnología!

¿La tecnología introduce algún sesgo en la muestra?

GenElute™-E no introduce sesgos que algunas tecnologías de “unión-lavado-elución” pueden agregar ya que en esta tecnología la separación es por tamaño, no por lo que se adsorbe y lo que se libera.

¿Sabemos cuán estable es el ADN purificado a través de varios ciclos de congelación-descongelación?

Esto fluctuará debido a la variabilidad de la muestra (recogida de la muestra, concentración, longitud del fragmento, secuencia [contenido de GC], almacenamiento antes del aislamiento, etc.). Sin embargo, la muestra se cambia de disolución tampón a un tampón de almacenamiento estándar que se incluye en el kit (1X TE).

En primer lugar, con respecto a la fragmentación y a la reducción de daño por corte asociados con varias centrifugaciones en una columna giratoria, ¿es esto relevante para el ARN? En segundo lugar, ¿cómo excluye la columna de cromatografía negativa las proteínas o glucoproteínas grandes con carga negativa cuando se desea extraer un ácido nucleico (específicamente ARN)?

• Las extracciones de ARN son propensas a la degradación de los fragmentos, normalmente como consecuencia de digestiones enzimáticas dentro de la muestra (ARNasas). Por consiguiente, es importante aislar el ácido nucleico de estas enzimas con la mayor rapidez posible. En un procedimiento típico de preparación mediante centrifugación con adsorción, lavado y elución, la fragmentación de la muestra se produce debido a los varios pasos de centrifugado, así como al proceso de unión de la biomolécula a una membrana o una microesfera o resina, y su liberación. La eliminación de estas variables del procedimiento de trabajo de aislamiento del ARN permite un mayor control de la calidad del fragmento de muestra final. Sin embargo, algunas aplicaciones posteriores no necesitan este nivel de control, ya que son menos sensibles a estas degradaciones. Los controles ayudan, en especial para muestras con menores rendimientos, y pueden contribuir a resolver problemas si los procesos posteriores fallan.
• Hay muchos métodos de cromatografía que aprovechan las diferencias entre las biomoléculas para su separación, como iones/carga para sílice. La “cromatografía negativa” funciona por exclusión por tamaño, permitiendo que se recojan primero los productos de mayor peso molecular. ¡Podemos entender totalmente lo intuitivo de equiparar nuestro uso de la palabra “negativo” y carga! Las proteínas, que son digeridas por las enzimas SmartLyse™, fluirán más despacio a través de la resina que las moléculas de ARN, y permanecerán dentro de la columna después de la centrifugación. Truco rápido: Si desea recoger estos fragmentos de proteína digeridos junto con las otras biomoléculas de menor peso molecular, puede centrifugar la columna después de la purificación a una mayor velocidad para recoger la fracción de movimiento más lento.