Concentración vírica mediante ultrafiltración

• Aislamiento, propagación y caracterización de virus
• Métodos generales para la propagación vírica
• Concentración de virus a reservas muy concentradas
• Concentración de virus con unidades de ultrafiltración para centrífuga Amicon^® Ultra
• Conclusiones
• Unidades de ultrafiltración para centrífuga

Aislamiento, propagación y caracterización de virus

Figura 1. Ultrafiltración para la concentración de virus. El líquido atraviesa la membrana de filtración, mientras que las partículas víricas grandes son retenidas.

Los métodos de aislamiento y propagación de virus son cruciales en investigación, producción de vacunas y procedimientos de trabajo de diagnóstico. En los laboratorios de investigación básica se utilizan concentrados víricos para estudiar la biología y la patogenia de los virus. La producción de vacunas requiere la preparación de virus a pequeña y gran escala. Y aunque en la mayoría de los laboratorios de diagnóstico se utilizan ahora enfoques distintos del cultivo para el diagnóstico de las enfermedades víricas, el aislamiento de los virus en cultivo celular sigue siendo un enfoque útil cuando se necesitan aislamientos viables, cuando deben diferenciarse los virus viables de los no viables y en los casos en los que los métodos basados en el cultivo pueden proporcionar resultados más rápido que los métodos distintos del cultivo.

Los virus pueden propagarse en cultivo celular para generar concentrados víricos. Las células cultivadas se inoculan con un concentrado vírico procedente de un inóculo de virus, una fuente comercial o un tejido infectado. Después de la incubación, se lisan las células infectadas para recolectar las partículas víricas o se recolecta el virus liberado directamente de los sobrenadantes celulares. A continuación, se valora el concentrado vírico, se distribuye en alícuotas y se conserva a −80 °C para su uso posterior.

El aislamiento de los virus de las muestras clínicas también explota el cultivo celular para la propagación vírica. Las muestras clínicas se preparan mediante homogeneización de la muestra y extracción en un medio líquido, que luego se centrifuga y se utiliza para inocular cultivos celulares.

Para conseguir reservas víricas de elevada concentración, es necesario concentrar las partículas de virus purificadas. Pueden utilizarse las unidades de ultrafiltración para centrífuga Amicon^® Ultra y Centricon^® Plus con membranas de celulosa regenerada para concentrar viriones y disoluciones de virus (Figura 1). En este protocolo se describe el uso de unidades de ultrafiltración para centrífuga Amicon^® y Centricon^® para la concentración de tres tipos comunes de virus: lentivirus, adenovirus y virus adenoasociados (AAV).

Método general para la propagación vírica

1. Células empaquetadoras: se cultivaron en placa las células hospedadoras hasta conseguir una confluencia del 80-85 %.
2. Transfección: se infectaron las células con partículas viables del virus.
3. Recolección vírica: dependiendo del virus, se utilizaron células del sobrenadante o del sedimento, o ambas, para purificar los viriones recombinantes. Se aplicaron cuatro rondas de ciclos de congelación/descongelación para liberar el virus de las células. A continuación se separaron los restos celulares del lisado celular mediante centrifugación. 
   
4. Purificación vírica: se purificaron los virus del lisado celular mediante ultracentrifugación en gradiente de densidad o cromatografía en columna o membrana.
5. Se concentraron las disoluciones víricas purificadas y se cambió la disolución tampón a una disolución de conservación adecuada utilizando diálisis pasiva, diafiltración o ultrafiltración centrífuga con las unidades Amicon^® Ultra y Centricon^® Plus 70.

Concentración del virus a reservas muy concentradas

Para producir reservas de elevada cantidad de virus, se puede concentrar el virus purificado utilizando ultrafiltración centrífuga. La elección correcta del dispositivo, el material de la membrana, el límite o corte de peso molecular, la velocidad de centrifugación, el tiempo de centrifugación y la composición de la disolución tampón son fundamentales para la gran recuperación de partículas víricas infecciosas. Las unidades de ultrafiltración para centrífuga Amicon^® Ultra han especificado límites de peso molecular nominal (NMWL) definidos por su membrana de filtración. Se utilizaron unidades de ultrafiltración para centrífuga Amicon^® Ultra Ultracel^® con un NMWL de 50 kDa para concentrar las disoluciones de adenovirus y de virus adenoasociados (AAV). Para la concentración de lentivirus, se utilizaron unidades con membranas de NMWL de 50 kDa y 100 kDa.

Factores que deben considerarse al seleccionar un método de ultrafiltración y el tamaño de peso molecular nominal de la membrana:

1. Tamaño de la partícula vírica: el tamaño puede calcularse a partir de las fuentes publicadas o mediante técnicas de medición como la microscopia, la difracción láser y la dispersión dinámica de la luz.
2. Tamaño de los principales objetivos de separación en la disolución: el tamaño de las proteínas, anticuerpos, fármacos, productos químicos y otras partículas que deben separarse afectará a la selección del tamaño de la membrana.
3. Volumen de la muestra: volúmenes de procesamiento que oscilan entre ≤0,5 ml y 70 ml son compatibles con las unidades de ultrafiltración en centrífuga (cUF).

Para retener partículas víricas, el corte de peso molecular de la membrana de filtración debe ser menor que el de la partícula (~2 veces más pequeño que el peso molecular de la partícula vírica), pero lo suficientemente grande como para permitir la filtración de los componentes más pequeños
(Tabla 1).

Tabla 1. Selección del NMWL de la membrana de ultrafiltración en función del tamaño de las partículas víricas.

NMWL (kDa) de la membrana de ultrafiltración	Tamaño nominal de poro (nm)	Intervalo recomendado de tamaño de retención nominal de ultrafiltración
		Diámetro (nm)		Peso molecular (kDa)
		Mínimo	Máximo	Mínimo	Máximo
3	0,3	1	1,5	6	20
10	1	3	9	20	90
30	3	9	15	60	180
50	5	15	30	100	300
100	10	30	90	200	900

Concentración de virus con unidades de ultrafiltración para centrífuga Amicon^® Ultra

En la Tabla 2 se muestran los resultados de la concentración de adenovirus, lentivirus y AAV procedentes de lisados celulares sin procesar y virus purificados por cromatografía. Las partículas víricas se concentraron eficazmente a elevadas concentraciones con altas recuperaciones utilizando unidades de ultrafiltración para centrífuga Amicon^® Ultra.

Tabla 2. Concentración de virus utilizando unidades de ultrafiltración. No recomendamos concentrar los virus a más de 10¹³ partículas/ml debido a la posible agregación del virus.

Muestra de partida	Unidad	Cantidad vírica de partida	Volumen inicial (ml)	Factor de concentración	Tiempo de centrifugación a 1500 x g (min)	Recuperación (%)
Adenovirus en lisados celulares sin procesar	Amicon® Ultra-4 50 kDa	1 x 108	4	X27	20	>100
Adenovirus purificado, en tampón salino 1 M	Amicon® Ultra-4 50 kDa	1 x 108	4	X45	10	85
AAV en lisados celulares sin procesar	Amicon® Ultra-4 50 kDa	2 x 107	4	X20	35	50
AAV en lisados celulares sin procesar	Amicon® Ultra-15 50 kDa	2 x 107	10	25X	45	76
AAV diluidos en tampón Tris 100 mM, NaCl 250 mM	Amicon® Ultra-4 50 kDa	5 x 106	4	X20	20	100
Lentivirus en sobrenadante de cultivo celular	Amicon® Ultra-4 100 kDa	9 x 104	4	X100	30	>100
Lentivirus en sobrenadante de cultivo celular	Amicon® Ultra-4 50 kDa	9 x 104	4	X100	30	93
Lentivirus en sobrenadante de cultivo celular	Centricon Plus-70 100 kDa	8 x 103	65	X80	30	81

Es importante recordar que la mayoría de los virus no se pueden concentrar y almacenar de manera eficiente en disoluciones tampón de baja concentración salina. La concentración centrífuga del virus en disoluciones salinas < 250 mM induce la agregación del virus y la disminución de la infectividad.

Las reservas víricas concentradas puede esterilizarse mediante filtración con filtros de 0,22 µm. Pueden utilizarse las unidades de filtración Ultrafree^®-MC GV para volúmenes < 0,5 ml.

Conclusiones

Desarrollamos un método para validar la ultrafiltración utilizando unidades para centrífuga Amicon^® Ultra y Centricon^® Plus como un medio rápido y rentable para lograr elevadas concentraciones de virus. Este método puede utilizarse para concentrar virus procedentes de sobrenadantes de cultivo celular, lisados celulares y otras fuentes. Después de la concentración, el material vírico puede esterilizarse por filtración utilizando filtros Ultrafree^®. Para la máxima recuperación de partículas víricas infecciosas, es fundamental seleccionar la unidad de ultrafiltración, la membrana de filtración, el corte de peso molecular (MWCO), la velocidad de centrifugación y el tiempo de centrifugación adecuados.

Unidades de ultrafiltración para centrífuga

Límite de peso molecular nominal de la unidad, NMWL (kDa)	Unidades de ultrafiltración para centrífuga Amicon® Ultra				Unidades para centrífuga Centricon® Plus70
	0,5 ml	2 ml	4 ml	15 ml	15 – 70 ml
3	UFC5003		UFC8003	UFC9003	UFC7003
10	UFC5010	UFC2010	UFC8010	UFC9010	UFC7010
10 (DIV*)			UFC4010D*	UFC9010D*
30	UFC5030	UFC2030	UFC8030	UFC9030	UFC7030
50	UFC5050	UFC2050	UFC8050	UFC9050
100	UFC5100	UFC2100	UFC8100	UFC9100	UFC7100

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